Лысова А.Н., Шатунова Е.П., Зарубина Е.Г.

Медицинский университет «Реавиз», г. Самара, Россия

ВЛИЯНИЕ ОДНОНУКЛЕОТИДНЫХ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНА KISS1 НА РАЗВИТИЕ У ЖЕНЩИН АНОВУЛЯТОРНОГО БЕСПЛОДИЯ

Актуальность проблемы связана с увеличением распространенности ановуляторного бесплодия у женщин и необходимостью повышения эффективности его лечения.
Цель – изучение влияния однонуклеотидных поолиморфизмов гена KISS1 на уровень половых гормонов, регуляторных пептинов и развитие у женщин ановуляторного бесплодия.
Материалы и методы. В исследовании приняли участие 73 женщины: в I группу вошли пациентки с подтвержденным диагнозом «Ановуляторное бесплодие» и нарушениями менструальной функции в виде олигоменореи и аменореи; II (контрольную) группу составили 28 пациенток, имевших в анамнезе одни или более нормальные роды здоровым ребенком. У всех женщин определялись уровни лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов, антимюллеров гормон. Уровни кисспептина и нейрокинина В определялись методом иммуноферментного анализа с помощью специальных коммерческих наборов. Из лейкоцитов периферической крови с использованием набора Puregene Blood Kit (QIAGEN, кат. № 158389) выделяли геномную ДНК для генотипирования KISS1. Полиморфизм определяли путем секвенирования нуклеотидов с использованием протокола ABI Big Dye Terminator на генетическом анализаторе ABI 3100 Avant. Дополнительно проводились: ультразвуковое исследование органов малого таза, контроль овуляции при помощи тест-полосок.
Результаты. Прямое секвенирование гена KISS1 выявило однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) rs4889 – генотипы CC, CG и GG. При этом гетерозиготный генотип GС гена KISS1 обладает защитными свойствами по отношению к ановуляторному бесплодию, а гомозиготные генотипы способствуют его развитию. Генотипы GG и СС ассоциируются с различными формами ановуляторного бесплодия по классификации ВОЗ: генотип GG с гипогонадотропной формой ановуляторного бесплодия (1 класс), генотип CC – с нормогонадотропной формой ановуляторного бесплодия (2 класс).
Изучение соотношений между различными генотипами и уровнем регуляторных пептидов показал существенное снижение уровня кисспептина и повышение уровня нейорокинина В у женщин с генотипом GG, что не противоречит современным данным о механизмах их действия. Кроме этого, при генотипе GG отмечается постоянно низкий уровень гонадотропинов на протяжении всего менструального цикла, при генотипе CC уровень гонадотропинов укладывался в референсные значения.
У всех женщин, включенных в исследование, определялся нормальный овариальный резерв, подтвержденный нормальными показателями АМГ. Данными ультразвукового исследования подтверждено наличие ановулятороного бесплодия у женщин с генотипами GG и СС. В обоих случаях ановуляция подтверждалась монофазной кривой ректальной температуры на всем протяжении менструального цикла и отрицательными данными теста FRAUTEST.
Заключение. Полученные результаты позволяют сделать предположение об участии однонуклеотидных полиморфизмов гена KISS1 (GG и СС) в развитии ановуляторного бесплодия.

Ключевые слова: кисспептин; ановуляторное бесплодие; генотип; однонуклеотидный полиморфизм; гормональный фон

Lysova A.N., Shatunva E.P., Zarubina E.G.

Medical University «Reaviz», Samara, Russia

INFLUENCE OF SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS OF THE KISS1 GENE ON THE DEVELOPMENT OF ANOVULATORY INFERTILITY IN WOMEN

The relevance of the problem is associated with the increasing prevalence of anovulatory infertility in women and the need to improve the effectiveness of its treatment.
Objective – to study the effect of single nucleotide polymorphisms of the KISS1 gene on the level of sex hormones, regulatory peptins and the development of anovulatory infertility in women.
Materials and methods. The study involved 73 women: group I included patients with a confirmed diagnosis of anovulatory infertility and menstrual dysfunction in the form of oligomenorrhea and amenorrhea; group II (control) consisted of 28 patients who had one or more normal births with a healthy child in their anamnesis. All women were determined to have levels of luteinizing and follicle-stimulating hormones, anti-Müllerian hormone. Kisspeptin and neurokinin B levels were determined by enzyme immunoassay using special commercial kits. Genomic DNA for KISS1 genotyping was isolated from peripheral blood leukocytes using the Puregene Blood Kit (QIAGEN, Cat. No. 158389). Polymorphism was determined by nucleotide sequencing using the ABI Big Dye Terminator protocol on an ABI 3100 Avant genetic analyzer. Additionally, the following were performed: ultrasound examination of the pelvic organs, ovulation control using test strips.
Results. Direct sequencing of the KISS1 gene revealed single nucleotide polymorphisms (SNP) rs4889 – genotypes CC, CG and GG. In this case, the heterozygous genotype GC of the KISS1 gene has protective properties against anovulatory infertility, and homozygous genotypes contribute to its development. The GG and CC genotypes are associated with various forms of anovulatory infertility according to the WHO classification: the GG genotype with the hypogonadotropic form of anovulatory infertility (class 1), the CC genotype with the normogonadotropic form of anovulatory infertility (class 2).
The study of the ratios between various genotypes and the level of regulatory peptides showed a significant decrease in the kisspeptin level and an increase in the level of neurokinin B in women with the GG genotype, which does not contradict modern data on the mechanisms of their action. In addition, with the GG genotype, there is a constantly low level of gonadotropins throughout the menstrual cycle, with the CC genotype, the gonadotropin level was within the reference values.
All women included in the study had a normal ovarian reserve, confirmed by normal AMH levels. Ultrasound data confirmed the presence of anovulatory infertility in women with the GG and CC genotypes. In both cases, anovulation was confirmed by a monophasic rectal temperature curve throughout the menstrual cycle and negative FRAUTEST test data.
Conclusion. The obtained results allow us to suggest the involvement of single nucleotide polymorphisms of the KISS1 gene (GG and CC) in the development of anovulatory infertility.

Key words: kisspeptin; anovulatory infertility; genotype; single nucleotide polymorphism; hormonal background

Репродуктивное здоровье женщин – важный медицинский и социальный аспект жизни общества, поскольку от него во многом зависит демографическая ситуация в каждой стране и в мире в целом, особенно на фоне общей тенденции старения населения и стремления женщин к социальному и карьерному росту, что приводит к «отложенному материнству». Мировая статистика неуклонно регистрирует ежегодное увеличение количества бездетных пар, которое в настоящее время превышает в среднем 15% среди лиц репродуктивного возраста, желающих иметь детей [1, 2].
Диагноз бесплодия может быть выставлен тем женщинам, у которых не наступает беременность при регулярной половой жизни со здоровым партнером без использования контрацептивов в возрасте до 35 лет в течение 1 года, или в течение 6 месяцев в возрастной категории старше 35 лет [3, 4]. Сложность лечения данной патологии связана как с полиэтиологичностью ее причины, что затрудняет диагностику, так и с многоступенчатостью регуляции репродуктивной сферы женщины. В настоящее время выделяют несколько уровней регуляции репродуктивной системы, начиная от коры головного мозга (первый уровень регуляции) до непосредственно самой матки (пятый уровень регуляции).
Одной из форм бесплодия у женщин является ановуляторное бесплодие (шифр 97.0 по МКБ 10). Оно составляет около 27,0% среди всех причин отсутствия наступления беременности. Сложность диагностики данного состояния обусловлена тем, что даже у абсолютно здоровых женщин в 3-4 циклах в год могут возникать ановуляторные состояния, что не считается патологией и требует длительного наблюдения и тщательного обследования для подтверждения диагноза.
В свою очередь, к патологической ановуляции могут приводить разнообразные нарушения, что также затрудняет диагностику ановуляторного бесплодия. К их числу можно отнести нарушение регуляторной функции гипофиза, гипоталамуса, заболевания щитовидной железы, симпатоадреналовой системы, изменения гормонального статуса, особенно связанные с повышением уровней пролактина и андрогенов, а также прием стероидных препаратов и препаратов гормональной контрацепции.
По нашим данным, показатели частоты ановуляторного бесплодия в Самарской области в 2018 году составляли 20,5% от общего количества женщин с бесплодием, что не превышает среднестатистические показатели в целом по стране. При этом заместительная терапия, которая лежит в основе лечения ановуляторного бесплодия, по данным N. Tadokoro (2017), даже после четырех циклов лечения ановуляции, завершается возникновением беременности не более чем у 70,0-74,0% пациенток [5, 6].
Цель исследования – изучение влияния полиморфизмов гена KISS1 на уровень половых гормонов, регуляторных пептинов и развитие у женщин ановуляторного бесплодия.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Для реализации поставленной цели среди пациенток г. Самары с подтвержденным ановуляторным бесплодием случайным методом нами были отобраны 45 пациенток (I группа) в возрасте от 29 до 33 лет (средний возраст 30,7 ± 1,5 года) с нарушением менструальной функции: олигоменореей (17 человек, 37,8%) и аменореей (28 человек, 62,2%). У всех пациенток изучались уровни лютеинизирующего гормона (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) электрохемилюминисцентным методом на автоматическом иммунохимическом анализаторе «Cobas е 411» для подтверждения у них ановуляторного бесплодия. Уровень анти-Мюллерова гормона (АМГ) использовался как критерий сохранности овариального резерва. Его определяли в сыворотке крови иммуноферментным методом на 3-5 сутки цикла с использованием набора реактивов «AMH Gen II ELISE». Для подтверждения отсутствия овуляции (на наличие овуляции в ближайшие 24 часа указывали две полоски на тесте, которые не появлялись при анаовуляторном цикле) применялись также тест-полоски FRAUTEST, чувствительность которых составляла 15 мМЕ/мл, а также изменение ректальной температуры.
Для уточнения причин ановуляторного бесплодия определяли уровень регуляторных пептинов-нейрокинина В и кисспептина в сыворотке крови пациенток. Уровень нейрокинина В определяли с помощью коммерческих наборов Neurokinin B (кат. №S-1271) твердофазным иммуноферментным методом, кисспептин – с помощью коммерческих наборов Кисспептин-54 (метастин) (кат. №S-1308) методом иммуноферментного анализа с экстракцией.
Для генотипирования из лейкоцитов периферической крови пациенток, включенных в исследование, с использованием набора Puregene Blood Kit выделяли геномную ДНК KISS1. Полиморфизм определяли путем секвенирования после полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием прямых и обратных праймеров. Секвенирование нуклеотидов проводили с использованием протокола ABI Big Dye Terminator на генетическом анализаторе ABI 3100 Avant.
Толщину эндометрия и объем яичников определяли ультразвуковым методом на аппарате 2000 Toshiba SSA-240 с использованием трансвагинального конвексного датчика с частотой 7,5 МГц.
В качестве контроля были обследованы 28 женщин (II группа) в возрасте 30,2 ± 1,6 лет, имевших в анамнезе одни или более нормальные роды здоровым ребенком.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время известно, что ген KISS1 кодирует выработку в организме человека кисспептина и располагается на длинном плече 1 хромосомы (локус 1q32.1). Кисспептин, связываясь со своим рецептором (GPR54), приводит к стимуляции высвобождения гонадотропина, который, в свою очередь, влияет на высвобождение ЛГ и ФСГ. Проведенные исследования генетического полиморфизма гена KISS1 позволяют предположить, что некоторые генотипы KISS1 могут быть фактором, негативно влияющим на гормональный статус женщин, и способствовать развитию у них ановуляторного бесплодия. Данные о распространенности генотипов (CC, CG и GG) гена KISS1 у женщин с овуляторным бесплодием и женщин контрольных группы представлены в таблице 1.

Таблица 1. Генотипы женщин (KISS1) в основной и контрольной группах
Table 1. Genotypes of women (KISS1) in the main and control groups

Группы	Соотношение генотипов, %
	GG		GC		CC
	абс.	%	абс.	%	абс.	%
I группа, n = 45	32	71,1	1	2,2	12	26,7
II (контрольная) группа, n = 28	1	3,6	25	89,3	2	7,1

Одновременно нами оценивалась распространенность аллелей гена KISS1 в группах обследованных женщин (табл. 2).

Таблица 2. Распространенность аллелей C и G гена KISS1 среди женщин, включенных в исследование
Table 2. Prevalence of C and G alleles of the KISS1 gene among women included in the study

Группы обследованных женщин	Страдающие бесплодием среди всех обследованных женщин, n = 45		Не страдающие бесплодием среди всех обследованных женщин, n = 28
	абс.	%	абс.	%
Количество пациенток с G аллелем в геноме	33	45,2	26	35,6
Количество пациенток с С аллелем в геноме	13	17,8	27	37,0

Как видно из полученных данных, для пациенток с ановуляторным бесплодием наиболее характерны генотипы GG (71,1%) и CC (26,7%), в то время как в контрольной группе в 89,3% случаев отмечался лишь генотип GC. Частота встречаемости аллеля G гена KISS1 в группе с ановуляторным бесплодием была достоверно выше (р ≤ 0,05), чем в группе здоровых женщин, в то время как для аллеля С гена KISS1 наблюдалось обратное соотношение.
По таблицам сопряженности нами с помощью критерия хи-квадрат Пирсона была оценена вероятность возникновения ановуляторного бесплодия при гомозиготных генотипах (GG и CC) гена KISS1 по сравнению с гетерозиготным генотипом GС, то есть мы определяли, имеются ли статистически значимые различия между частотой лиц с ановуляторным бесплодием среди лиц с генотипами GG и GС, а также с генотипами CC и GС. Число степеней свободы (f) для каждой таблицы сопряженности определяли по формуле f = (2 – 1) × (2 – 1) = 1. Критическое значение критерия хи-квадрат Пирсона находили по таблице, которое при уровне значимости p = 0,05 и числе степеней свободы 1 составляет 3,841, а при p = 0,001 – 6,635. Результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3. Взаимосвязь генотипа и наличия ановуляторного бесплодия по критерию хи-квадрат
Table 3. Interrelationship between genotype and the presence of anovulatory infertility according to the χ²

	Критическое значение хи-квадрат		Значение χ2
	χ2 при p = 0,05	χ2 при p = 0,001
Генотип GG	3,841	6,635	23,5
Генотип СС	5,4	0,05	39,6

Таким образом, на основе полученных данных с вероятностью р ≤ 0,001 по критерию хи-квадрат можно утверждать, что гомозиготность гена KISS1 чаще встречается у пациенток с ановуляторным бесплодием.
Изучение соотношений между генотипом и уровнем регуляторных пептинов представлено в таблице 4.

Таблица 4. Соотношение между генотипами женщин (KISS1) в основной и контрольной группах и уровнем регуляторных пептинов
Table 4. The relationship between the genotypes of women (KISS1) in the main and control groups and the level of regulatory peptides

Группы	Соотношение генотипов, %
	I группа, n = 44*		II (контрольная) группа, n = 25*
	GG	CC	GC
Кисспептин пг/мл	0,221 ± 0,004	0,376 ± 0,007	0,512 ± 0,009
Нейрокинин В, пг/мл	69,1 ± 1,9	59,7 ± 1,8	51,8 ± 1,7

Примечание: * – один пациент из I группы с генотипом GC; один пациент с генотипом GG и два пациента с генотипом СС из II (контрольной) группы в расчет не включались ввиду малочисленности выборки.
Note: * – one patient from group I with the GC genotype; one patient with the GG genotype and two patients with the CC genotype from group II (control) were not included in the calculation due to the small sample size.

Возможно, что при более значимых выборках, эти соотношения могут измениться. Тем не менее, расчет достоверности разницы в уровнях регуляторных пептинов показал, что их показатели достоверно отличаются у пациенток с различными генотипами (табл. 5). Наиболее низкий уровень кисспептина и самые высокие показатели нейрокинина В зарегистрированы у женщин с GG генотипом, что, по-видимому, обусловлено механизмами их взаимодействия по принципу обратной связи – уровень нейрокинина В компенсаторно возрастает на фоне снижения синтеза кисспептина, поскольку нейрокинин В стимулирует выработку кисспептина [7, 8].

Таблица 5. Достоверность разницы в уровнях регуляторных пептинов у женщин с различными генотипами (KISS1)
Table 5. Reliability of differences in regulatory peptine levels in women with different genotypes (KISS1)

Соотношение генотипов	Достоверность разницы уровней кисспептина		Достоверность разницы уровней нейрокинина В
	Критерий Стьюдента	р ≤	Критерий Стьюдента	р ≤
GG / CC	19,23	0,001	3,59	0,001
GG / GC	29,55	0,001	6,78	0,001
CC / GC	11,93	0,001	3,19	0,01

Изучение гормонального фона у пациенток основной и контрольной групп выявило отличия у обследованных женщин с различными генотипами KISS1 (табл. 6).

Таблица 6. Характеристики гормонального фона у пациенток основной и контрольной групп
Table 6. Characteristics of hormonal background in patients of the main and control groups

Группы	Референсные значения гормонов	Уровень гормонов у женщин с различными генотипами
		I группа*		II (контрольная) группа*
		GG, n = 32	CC, n = 12	GC, n = 25
ФСГ, мЕд/мл Фолликулярная фаза Овуляторная фаза	1,37–9,90 6,17–17,20	1,11 ± 0,03 2,86 ± 0,6	3,21 ± 0,08 7,11 ± 0,5	5,47 ± 0,8 12,12 ± 0,8
ЛГ, мЕд/мл Фолликулярная фаза Овуляторная фаза	1,68–15,00 21,90–56,60	1,23 ± 0,04 11,17 ± 0,7	4,51 ± 0,4 22,48 ± 0,6	9,29 ± 0,5 39,25 ± 0,9
АМГ(среднее), нг/мл для возраста 26-40 лет	1,3–7,37	4,0 ± 0,10	5,5 ± 0,08	4,8 ± 0,08
Данные о наличии овуляции согласно теста FRAUTEST (на протяжении 6 месяцев наблюдения)		Овуляция отсутствует (1 полоска)		Овуляция присутствует (2 полоски)
Характер кривой ректальной температуры (на протяжении 6 месяцев наблюдения)		Монофазная кривая		Есть пик температуры

Примечание: * – один пациент из I группы с генотипом GC; один пациент с генотипом GG и два пациента с генотипом СС из II (контрольной) группы в расчет не включались ввиду малочисленности выборки.
Note: * – one patient from group I with the GC genotype; one patient with the GG genotype and two patients with the CC genotype from group II (control) were not included in the calculation due to the small sample size.

У женщин I группы (согласно классификации ВОЗ, которая выделяет 3 класса ановуляторного бесплодия в соответствии с уровнями гонадотропинов) можно было говорить об ановуляторном бесплодии 1 класса (генотип GG), где отмечался монотонно низкий уровень гонадотропинов на протяжении менструального типа. При наличии генотипа СС у пациенток I группы уровень гонадотропинов хоть и был ниже, чем в группе контроля, но не выходил за пределы референсных значений, что соответствовало 2 классу ановуляторного бесплодия (по классификации ВОЗ). При этом у всех женщин, включенных в исследование, как I, так и II (контрольной) групп, имелся достаточный овариальный резерв (уровень АМГ выше 1,2 нг/мл). Вместе с тем, было отмечено, что уровень АМГ был выше у женщин I группы (с генотипом (СС) по сравнению с женщинами из группы контроля (генотип GC). Достоверность различий гормонального фона у женщин с разными генотипами представлена в таблице 7.

Таблица 7. Достоверность разницы в уровнях регуляторных пептинов у женщин с различными генотипами (KISS1)
Table 7. Reliability of differences in levels of regulatory peptines in women with different genotypes (KISS1)

Ультразвуковое исследование показало, что у пациенток с генотипом GG размеры яичников составляли в среднем 4,3 ± 0,4 см³, имелось небольшое количество антральных фолликулов диаметром до 3,5 ± 0,3 мм. У пациенток с генотипом СС более характерными признаками было сохранение нормальных размеров яичников и диаметр антральных фолликулов до 8,8 ± 0,5 мм при отсутствии доминантных фолликулов. В обоих случаях ановуляция дополнительно подтверждалась монофазной кривой ректальной температуры на всем протяжении менструального цикла и отрицательными данными теста FRAUTEST.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, на основе полученных данных можно с достаточной долей вероятности предполагать участие однонуклеотидных полиморфизмов гена KISS1 в формировании ановуляторного бесплодия на фоне изменения уровня регуляторных пептинов (в первую очередь кисспептина). При этом гетерозиготный генотип GС гена KISS1 обладает защитными свойствами по отношению к ановуляторному бесплодию, а гомозиготные генотипы способствуют его развитию. Генотипы GG и СС ассоциируются с различными формами ановуляторного бесплодия по классификации ВОЗ: генотип GG с гипогонадотропной формой ановуляторного бесплодия (1 класс), генотип CC – с нормогонадотропной формой ановуляторного бесплодия (2 класс).

Информация о финансировании и конфликте интересов

Исследование не имело спонсорской поддержки.
Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES:

1.          Ruohonen ST, Poutanen M, Tena-Sempere M. Role of kisspeptins in the control of the hypothalamic-pituitary-ovarian axis: old dogmas and new challenges. Fertil Steril. 2020; 114(3): 465-474. doi: 10.1016/j.fertnstert.2020.06.038
2.          Navarro VM, Tena-Sempere M. Neuroendocrine control by kisspeptins: role in metabolic regulation of fertility. Nat Rev Endocrinol. 2022; 8(1): 40-53. doi: 10.1038/nrendo.2011.147
3.          Yatsenko SA, Rajkovic A. Genetics of human female infertility. Biol Reprod. 2019; 101(3): 549-566. doi: 10.1093/biolre/ioz084
4.          Abbara A, Clarke SA, Dhillo WS. Clinical Potential of Kisspeptin in Reproductive Health. Trends Mol Med. 2021; 27(8): 807-823. doi: 10.1016/j.molmed.2021.05.008
5.          Lees B, Brown J. Endometriosis and infertility: a review of the pathogenesis and treatment of endometriosis-associated infertility. Obstet Gynecol Clin North Am. 2022; 39(4): 535-549. doi: 10.1016/j.ogc.2022.10.002
6.          Popuri V, Tadokoro T, Croteau DL, Bohr VA. Human RECQL5: guarding the crossroads of DNA replication and transcription and providing backup capability. Crit Rev Biochem Mol Biol. 2017; 48(3): 289-299. doi: 10.3109/10409238.2017.792770
7.          García-Galiano D, Pinilla L, Tena-Sempere M. Sex steroids and the control of the Kiss1 system: developmental roles and major regulatory actions. J Neuroendocrinol. 2022; 24(1): 22-33. doi: 10.1111/j.1365-2826.2011.02230.x
8.          Ruohonen ST, Gaytan F, Usseglio Gaudi A, Velasco I, Kukoricza K, Perdices-Lopez C, et al. Selective loss of kisspeptin signaling in oocytes causes progressive premature ovulatory failure. Hum Reprod. 2022; 37(4): 806-821. doi: 10.1093/humrep/deab287

Корреспонденцию адресовать:

ЛЫСОВА Анна Николаевна
443001, г. Самара, ул. Чапаевская, д. 227, Медицинский университет «Реавиз»
Тел: 8 (846) 333-54-51    E-mail: lysovaann@mail.ru

Сведения об авторах:

ЛЫСОВА Анна Николаевна
канд. мед. наук, проректор по международному сотрудничеству и образованию, Медицинский университет «Реавиз», г. Самара, Россия
E-mail: lysovaann@mail.ru

ШАТУНОВА Елена Петровна
доктор мед. наук, профессор, зав. кафедрой акушерства и гинекологии, Медицинский университет «Реавиз», г. Самара, Россия
E-mail: e.shatunova@mail.ru

ЗАРУБИНА Елена Григорьевна
доктор мед. наук, профессор, зав. кафедрой медико-биологических дисциплин, Медицинский университет «Реавиз», г. Самара, Россия
E-mail: zarubina@reaviz.online

Information about authors:

LYSOVA Anna Nikolaevna
candidate of medical sciences, vice-rector for international cooperation and education, Medical University “Reaviz”, Samara, Russia
E-mail: lysovaann@mail.ru

SHATUNOVA Elena Petrovna
doctor of medical sciences, professor, head of the department of obstetrics and gynecology, Medical University “Reaviz”, Samara, Russia
E-mail: e.shatunova@mail.ru

ZARUBINA Elena Grigoryevna
doctor of medical sciences, professor, head of the department of medical and biological disciplines, Medical University “Reaviz”, Samara, Russia
E-mail: zarubina@reaviz.online