Шабалдин А.В., Ровда Ю.И., Синицкая А.А., Дадонова А.В., Шмулевич С.А., Халивопуло И.К., Черных Н.С.

Кемеровский государственный медицинский университет, НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний,
г. Кемерово, Россия

ОЦЕНКА КОЛИЧЕСТВА Т-РЕЦЕПТОРНЫХ ЭКСЦИЗИОННЫХ КОЛЕЦ (TREC) И КАППА-ДЕЛЕЦИОННЫХ РЕКОМБИНАЦИОННЫХ ЭКСЦИЗИОННЫХ КОЛЕЦ (KREC) У ДЕТЕЙ С ВРОЖДЕННЫМИ ПОРОКАМИ СЕРДЦА И С ВЫНУЖДЕННОЙ ТИМЭКТОМИЕЙ

Целью настоящего исследования была оценка уровней Т-рецепторных эксцизионных колец (TREC) и каппа-делеционных рекомбинационных эксцизионных колец (KREC) у детей первого года жизни с врожденными пороками сердца (ВПС) и вынужденной тимэктомией.
Проведено количественное определение копий TREC, KREC и гена IL17RA, в выделенной ДНК из 100 мкл цельной крови 28 детей раннего возраста с ВПС, представленных дефектами межжелудочковой и межпредсердной перегородок, а также их сочетаниями между собой и с пороками клапанов и сосудов сердца. Вынужденная тимэктомия выполнена у 14 детей (возраст 0,4 ± 0,2 года), у 14 пациентов (возраст 1,1 ± 0,3 лет) тимус был сохранен (операция из мини доступа или путем эндоваскулярного вмешательства).
Проведенное исследование показало положительную корреляцию между возрастом детей и уровнем TREC в периферической крови, и отрицательную зависимость возраста и уровней KREC. У детей с ВПС и вынужденной тимэктомией количество TREC было значимо ниже, чем у детей с сохраненным тимусом и условно здоровых новорожденных детей. Количество KREC у детей с ВПС и вынужденной тимэктомией было значимо выше, чем у детей без нее.
Проведение вынужденной тимэктомии у детей первого года жизни при хирургическом лечении ВПС является фактором риска формирования у них иммунодефицитных состояний.

Ключевые слова. TREC; KREC; врожденные пороки сердца; вынужденная тимэктомия

Shabaldin A.V., Rovda Yu.I., Sinitskaya A.A., Dadonova A.V., Shmulevich S.A., Khalivopoulo I.K., Chernykh N.S.

Kemerovo State Medical University, Scientific Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases,
Kemerovo, Russia

ASSESSMENT OF THE NUMBER OF T-CELL RECEPTOR EXCISION CIRCLE (TREC) AND KAPPA-DELETING RECOMBINATION EXCISION CIRCLE (KREC) IN CHILDREN WITH CONGENITAL HEART DEFECTS AND WITH FORCED THYMECTOMY

The aim of this study was to evaluate the levels of TREC and KREC in children of the first year of life with congenital heart defects (CHD) and forced thymectomy.
Copies of TREC, KREC and the IL17RA gene were quantified in isolated DNA from 100 µl of whole blood of 28 infants with congenital heart disease, represented by defects in the interventricular and interatrial septa, as well as their combinations with each other and with defects in the valves and blood vessels of the heart. The forced thymectomy was performed in 14 children (age 0.4 ± 0.2 years), the thymus was preserved (operation from a mini-access or by endovascular intervention) in 14 patients (age 1.1 ± 0.3 years).
The study showed a positive correlation between the age of children and the level of TREC in peripheral blood, and a negative relationship between age and KREC levels. In children with congenital heart disease and forced thymectomy, the amount of TREC was significantly lower than in children with preserved thymus and conditionally healthy newborns. The number of KRECs in children with CHD and forced thymectomy was significantly higher than in children without it.
Carrying out forced thymectomy in children of the first year of life in the surgical treatment of CHD is a risk factor for the formation of immunodeficiency states in them.

Key words: TREC; KREC; congenital heart disease; forced thymectomy

По данным европейского регистра врожденных аномалий и пороков развития плода и новорожденного ребенка (https://eu-rd-platform.jrc.ec.europa.eu/eurocat/eurocat-data/prevalence_en.), а также эпидемиологических исследований в России, врожденные пороки сердца (ВПС) остаются самыми часто встречающимися аномалиями плода и новорожденного ребенка [1]. Хирургическое лечение ВПС сдвигается в сторону неонатального, а в дальнейшем, и пренатального периодов [2]. Открытые операции на сердце требуют вынужденного удаления тимуса для установки аппарата искусственного кровообращения. Соответственно, часть детей с ВПС подвержены вынужденной тимэктомии с периода новорожденности до периода раннего детства. Тимус рассматривается как производное иммунной системы и, в большей степени, как ее центральный орган. Он продолжает определять иммунную стратегию организма в раннем постнатальном периоде.
С этих позиций, иммунопатологические состояния напрямую зависят от качества вилочковой железы и ее наличия. Предметом дискуссии является вопрос избыточной инфекционной заболеваемости (чаще вирусной и бактериальной этиологии) у категории больных с вынужденно удаленным тимусом. В этом вопросе оппоненты придерживаются прямо противоположных точек зрения. Отечественные ученые более категоричны с ответом «о более высокой заболеваемости и наличии иммунодефицита» и иллюстрируют это достаточно большим исследовательским материалом. Тем не менее, точка зрения зарубежных исследователей также заслуживает внимания, где в качестве доказательств приводятся факты благополучных долгосрочных прогнозов у этих детей при лонгитудинальных исследованиях.
Достаточно разноречивы и немногочисленные работы по оценке иммунного статуса у вынужденно тимэктомированных детей для диагностики иммунопатологических состояний. Особое значение имеет не только оценка различных регуляторных лимфоцитов, но и количественное определение Т-рецепторных эксцизионных колец – TREC и их аналогов для В-клеточного рецептора (эксцизионные кольца В-клеточного рецептора) – KREC [3]. Эти исследования особо актуальны у вынужденно тимэктомированных детей.
Кроме того, сами по себе ВПС являются одной из нозологий, часто ассоциированной с первичными иммунодефицитными состояниями, синдромом Ди-Джорджи и другой патологией, связанной с делецией короткого плеча 22 хромосомы.
Исходя из этого, целью настоящего исследования была оценка уровней TREC и его аналога, образующегося при созревании В-лимфоцитов (KREC) у детей раннего постнатального периода с врожденными пороками сердца и вынужденной тимэктомией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для выполнения поставленной цели было выполнено количественное определение копий TREC, KREC и гена рецептора интерлейкина 17 (IL17RA, в качестве внутреннего контроля взятия материала) в ДНК, выделенной из 100 мкл периферической крови 28 детей (17 мальчиков и 11 девочек) неонатального, грудничкового и раннего возраста (от 2 дней до 1 года 3 месяцев постнатальной жизни) с ВПС. В настоящий момент отсутствуют многоцентровые исследования уровней TREC и KREC у детей первых трех лет жизни с ВПС и удаленным тимусом. С этих позиций данное исследование можно расценивать как пилотное. Расчет мощности выборки был выполнен с помощью on-line калькулятора https://clincalc.com/stats/samplesize.aspx, где использовался вариант «one study group vs. population» (dichotomous yes/no) для ожидаемой и наблюдаемой заболеваемости (комбинированный первичный иммунодефицит – КПИД). По данным литературы, частота встречаемости КПИД в популяции равна 1 : 1000000 детей, родившихся живыми [4, 5]. В то же время, частота этой же патологии в группе детей с септальными врожденными пороками сердца может достигать 3% (синдром делеции короткого плеча 22 хромосомы) [6]. При внесении этих показателей в on-line калькулятор и задание вероятности ошибки первого рода на уровне 0,05, а второго рода – 0,2, размер выборки детей с септальными ВПС был определен 13 индивидуумами, что в 2 раза меньше сформированной основной группы.
ВПС у обследованных детей были представлены дефектами межжелудочковой и межпредсердной перегородок, а также их сочетаниями между собой и с пороками клапанов и сосудов сердца (табл. 1).

Таблица 1. Распределение нозологических форм врожденных пороков сердца у детей раннего возраста
Table 1. Distribution of nosological forms of congenital heart defects in young children

ВПС	Абсолютное	%
ДМПП	7	25,000
ДМЖП	4	14,286
ДМПП, ДМЖП	3	10,714
ДМПП, ДМЖП, ОАП	3	10,714
ДМЖП, ОАП	3	10,714
Тетрада Фалло	2	7,143
ДМПП, ЧАДЛВ	1	3,571
ДМПП, ЛГ	2	7,143
ДМПП, ДМЖП, ЛГ	2	7,143
СМК, НТК, ДМЖП	1	3,571

Примечание (Note): ДМПП – дефект межпредсердной перегородки (atrial septal defect), ДМЖП – дефект межжелудочковой перегордки (ventricular septal defect), ОАП – открытый артериальный проток (patent ductus arteriosus), ЛГ – лёгочная гипертензия (pulmonary hypertension), НТК – недостаточность трикуспидального клапана (tricuspid valve insufficiency), СМК – стеноз митрального клапана (mitral valve stenosis), ЧАДЛВ – частичный аномальный дренаж лёгочных вен (partial anomalous pulmonary venous return).

Основная группа была представлена 14 детьми в возрасте 12,6 ± 1,8 недель с вынужденной тимэктомией при хирургической коррекции ВПС. Группа сравнения была сформирована из 14 детей в возрасте 37,4 ± 5,9 недель с сохраненным тимусом при хирургической коррекции ВПС. Особенности анамнеза этих детей представлены в таблице 2, из которой видна сопоставимость этих групп по перинатальному анамнезу.

Таблица 2. Особенности анамнеза и хирургического лечения обследованных детей
Table 2. Features of the medical history and surgical treatment of the examined children

Показатели	Основная группа	Группа сравнения	Контрольная группа
Срок гестации родов, в неделях	39,4 ± 1,6	40,3 ± 1,8	40,1 ± 0,9
Вес при рождении, в граммах	3750,6 ± 113,4	4002,6 ± 213,9	3549,6 ± 237,6
Оценка по АПГАР при рождении, в баллах	5,3 ± 0,7	6,9 ± 0,8	7,6 ± 1,2
Оценка по АПГАР через 5 минут после рождения, в баллах	7,9 ± 0,6	8,3 ± 0,4	9,1 ± 0,9
Срок установления ВПС, в сутках после рождения	4,2 ± 0,3	3,8 ± 0,5	0*
Срок проведения хирургической коррекции ВПС, в неделях после рождения	23,6 ± 1,8	51,4 ± 5,9	0*
Срок удаления тимуса, в неделях после рождения	23,6 ± 1,8	0*	0*
Срок обследования детей на TREC и KREC, в неделях	24,4 ± 1,6	52,4 ± 4,7	0,09 ± 0,02
Синдромы первичного иммунодефицита (тяжелый инфекционный, гематологический), в % от всей группы	0	0	0
Срединная стернотомия, аппарат искусственного кровообращения, закрытие дефекта заплатой из ксеноперикарда, в % от всей группы	100	0	0
Правосторонняя аксилярная торакотомия, аппарат искусственного кровообращения, закрытие дефекта заплатой из ксеноперикарда, в % от всей группы	0	100	0

Примечание: * – не проводилось. Показатели представлены в виде средней арифметической и стандартной ошибки средней, так как показатели имели нормальное распределение.
Note: * – not carried out. The indicators are presented as the arithmetic mean and standard error of the mean, since the indicators had a normal distribution.

Основным отличием было то, что дети основной группы оперировались в более ранний срок и операция была срединная стернотомия с удалением тимуса. В группе сравнения была проведена правосторонняя аксилярная торактотомия и тимус был сохранен. В то же время, в этих группах (основная и сравнения) операции выполнялись с применением искусственного кровообращения и дефекты закрывались заплатами из одного материала (ксеноперикард). В качестве контроля была собрана кровь 50 детей (27 девочек и 23 мальчика) периода новорожденности (от 1 до 5 суток постнатальной жизни) в отделении физиологии родильного дома Областной детской клинической больницы имени Ю.А. Атаманова, г. Кемерово. По перинатальному анамнезу эта группа не отличалась от основной группы и группы сравнения. У всех пациентов с ВПС и детей контрольной группы был выполнен забор периферической крови для выделения ДНК. В основной группе и в группе сравнения забор крови выполнялся в момент выписки из стационара, это было необходимо для создания временного интервала после хирургической коррекции ВПС. В основной группе этот интервал составил 14,8 ± 2,3 дней; а в группе сравнения – 10,5 ± 1,7 дней. Как видно из таблицы 2, полной сопоставимости групп по возрасту, по срокам проведения хирургической коррекции ВПС (для основной и группы сравнения) в настоящем исследовании создать не удалось, но все дети были раннего постнатального периода (от неонатального до младенчества), исследование TREC и KREC проводилось по одной методике с выделением ДНК из 100 мкл периферической крови и это было пилотное исследование С этих позиций сравнение количества TREC и KREC в сравниваемых группах возможно.
Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом ФГБНУ НИИ КПССЗ (г. Кемерово). До включения в работу от матерей обследованных детей было получено письменное информированное согласие.
Выделение ДНК проводили из 100 мкл периферической крови на колонках DNA-blot-kit. Общий анализ крови выполнялся из этой же крови.
Количественное определение TREC, KREC было проведено с помощью мультиплексной тест-системы, разработанной в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (ИХБФМ СО РАН, г. Новосибирск). Набор реагентов адаптирован для проведения qPCR на приборе CFX96 (Bio-Rad Laboratories).
Мультиплексную полимеразно-цепную реакцию (ПЦР) в режиме реального времени проводили в амплификаторе CFX96, для построения калибровочных кривых использовали входящие в состав набора калибраторы с концентрацией 2,5 копий/мкл (К3); 150 копий/мкл (К2), 9000 копий/мкл (К3) и негативный контроль (NC). Количество копий анализируемых ДНК мишеней TREC, KREC и IL17RA рассчитывали исходя из полученных калибровочных кривых с помощью программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager. Для перевода величины копий/мкл в копии в 1000 лейкоцитарных клеток использовали инструкцию к наборам и ранее проведенные исследования [7].
Учет и интерпретация результатов анализа проводили на основании значений порогового цикла Ct (пересечение кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией) и исходя из заданных значений калибраторов (К1, К2, К3). Построение калибровочной прямой и расчет значений копий TREC, KREC и ALB (копий гена IL17RA) происходило в автоматическом режиме. Учитывали, чтобы полученные значения Ct (в том числе для калибраторов) укладывались в диапазон значений, приведенных в приложении к набору реагентов; эффективность амплификации находилась в пределах от 90% до 105%, а коэффициент корреляции R² был не меньше 0,97.
Концентрация ДНК ALB (копий гена IL17RA) была более 10² копии/мкл во всех анализируемых образцах.
В инструкциях к набору для определения TREC (KREC) введен термин – «нормированное количество копий TREC (KREC)», которое рассчитывается на 10⁵ ядер-содержащих клеток (лейкоцитов/лимфоцитов) с учетом внутреннего контроля ALB по формуле: нормированное количество (TRECn или KRECn) = (количество копий TREC или KREC на мкл) / количество копий ALB на мкл) × 200000. Необходимо отметить, что, согласно математическим правилам, при делении коп/мкл (TREC или KREC) на коп/мкл (ALB), сами «коп/мл» сокращаются, и поэтому данная формула реально отражает кратность изменений TREC или KREC по отношению к внутреннему контролю (копий гена IL17RA) в 10⁵ лейкоцитарных/лимфоцитарных клетках. Соответственно, далее использовали аббревиатуру кратность TREC или KREC на 10⁵ лейкоцитарных/лимфоцитарных клеток периферической крови.
В то же время, данный методический подход использовался в большинстве исследований TREC и KREC в Российской Федерации, и поэтому полученные данные можно сопоставлять с ранее представленными результатами [7-9].
Статистическую обработку результатов исследования проводили при помощи пакета программ Statistica 10.0. Количественные данные представлены в виде медианы (Me), а также 25-го и 75-го квартилей (Q25 – UQ и Q75 – LQ). Для сравнения показателей между группами использовался U-критерий Манна-Уитни. Для выявления зависимости количества TREC и KREC от возраста выполнялась корреляция по Спирмену с вычислением коэффициента R. Вероятность ошибки первого рода была установлена на уровне 0,05, второго рода – 0,2.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Проведенное исследование показало, что медиана возраста детей с ВПС и вынужденной тимэктомией была меньше, чем у детей с сохраненным тимусом, но статистически значимых отличий по возрасту для сравниваемых групп не получено. Это указывает, что в группе с вынужденной тимэктомией были дети первых дней жизни, а в группе детей с сохраненным тимусом были дети старше одного года (табл. 3).

Таблица 3. Сравнительный анализ показателей периферической крови и уровней TREC и KREC у детей с врожденными пороками сердца и с вынужденной тимэктомией
Table 3. Comparative analysis of peripheral blood parameters and levels of TREC and KREC in children with congenital heart defects and forced thymectomy

Показатели	Тимус удален			Тимус сохранен			p-level
	Me	25% PQ	75% PQ	Me	25% PQ	75% PQ
Возраст, год	0,46	0,04	0,88	1,09	0,34	1,46	> 0,05
Лейкоциты, тыс/мкл	7,92	6,48	9,37	10,68	5,89	12,19	> 0,05
Лимфоциты, тыс/мкл	4,19	2,34	6,04	5,66	4,09	6,15	> 0,05
KREC кратность на 105 лейкоцитов / лимфоцитов	4295,1	1019,9	7570,1	3476,1	987,2	4263,1	< 0,001*
TREC кратность на 105 лейкоцитов / лимфоцитов	1357,4	255,3	2459,5	3398,1	304,8	4979,9	< 0,001*

Примечание (Note): * – статистическая значимость (statistical significance).

По результатам исследования показатели клеточного состава периферической крови статистически значимо не различались, как по числу лейкоцитов, так и лимфоцитов (табл. 3).
Статистически значимые различия получены для кратности TREC и KREC на 10⁵ лейкоцитов/лимфоцитов в сравниваемых группах (табл. 3).
Как видно из таблицы 2, кратность TREC на 10⁵ лейкоцитов/лимфоцитов в периферической крови у детей с ВПС, как минимум, через 10 дней после вынужденной тимэктомии была статистически значимо ниже по отношению к детям с ВПС и сохраненным тимусом. Эти данные указывают на важное значение тимуса в период раннего детства как центрального органа иммунной системы, где продолжаются процессы дифференцировки Т-лимфоцитов с образованием Т-клеточных рецепторов.
Из таблицы 3 также видно, что кратность KREC на 10⁵ лейкоцитов/лимфоцитов в периферической крови у детей с ВПС, как минимум, через 10 дней после вынужденной тимэктомии была статистически значимо выше по отношению к детям с ВПС и сохраненным тимусом. Вполне вероятно, что это обусловлено компенсаторными процессами, реализующимися через красный костный мозг и активацию синтеза В-клеточного рецептора.
При сравнении уровней KREC и TREC между группой контроля (здоровые дети периода новорожденности), группой сравнения (дети с ВПС и сохраненным тимусом раннего постнатального периода) и основной группой (дети с ВПС и удаленным тимусом неонатального и грудничкового периода) были выявлены статистически значимые различия. Так, в период новорожденности медиана уровней KREC была равна 10106 кратность/10⁵ лейкоцитов, в то время как у детей раннего постнатального периода с ВПС и сохраненным тимусом медиана этого показателя была в 3 раза меньше (3476 кратность/10⁵ лейкоцитов). В то же время, из таблицы 4 видно, что отклонения от медианы очень существенные, как в сторону 25% PQ, так и в сторону 75% PQ. Эти данные указывают на то, что у новорожденных детей функциональность первичных органов иммунной системы различная, и она может отражаться как в количестве KREC, так и TREC. Так, у 5 новорожденных детей уровни KREC были выше 12000 кратностей на 10⁵ лейкоцитов периферической крови, у остальных детей эти величины были в пределах от 1000 до 7000 кратностей на 10⁵ лейкоцитов периферической крови. У детей неонатального и грудничкового периода с ВПС и удаленным тимусом медиана уровней KREC была статистически значимо выше по отношению к группе сравнения (ВПС с сохраненным тимусом) и в два раза ниже, чем в контрольной группе (здоровые новорожденные дети). Эти различия могут быть обусловлены и возрастным интервалом в основной группе: от периода новорожденности до грудничкового периода.

Таблица 4. Сравнительный анализ показателей TREC и KREC у детей с врожденными пороками сердца и с вынужденной тимэктомией с группой здоровых новорожденных детей
Table 4. Comparative analysis of TREC and KREC indices in children with congenital heart defects and forced thymectomy with a group of healthy newborns

Примечание: p-level между всеми группами для KREC и TREC был < 0,001.
Note: p-level between all groups for KREC and TREC was < 0.001.

Исследование уровней TREC в выше описанных группах показало статистически значимые различия, характеризующие их низкий уровень по отношению к контролю как в группе сравнения, так и в основной группе. Причем, дефицит уровней TREC в группе сравнения по отношению к контролю был более чем в 2 раза, в основной группе – более чем в 7 раз. Необходимо отметить тот же самый высокий разброс показателей TREC в контрольной группе новорожденных детей. Так, у 6 детей уровень TREC превышал 13000 кратностей на 10⁵ лейкоцитов периферической крови, у остальных детей эти величины были в пределах от 900 до 8000 кратностей на 10⁵ лейкоцитов периферической крови. Это еще раз подтверждает факт различного функционирования тимуса у новорожденных детей (от реактивно избыточного через эйтоничное к депрессивному), что может отражаться в количестве TREC в лейкоцитах периферической крови новорожденных детей. Выраженное различие уровней TREC между контролем и группой сравнения может быть связано с возрастом обследованных детей и с наличием у них основного заболевания (септального врожденного порока сердца), которое могло вносить дополнительный вклад в дефицит синтеза T-клеточного рецептора. Основная группа была ближе к контролю по возрасту, в ней были дети периода новорожденности, но дефицит TREC по отношению к контролю был очень высокий (p < 0,001). С этих позиций можно говорить о выраженном вкладе тимэктомии, выполненной в неонатальном или грудничковом периоде, в формирование иммунодефицита у детей, подвергшихся хирургической коррекции ВПС.
Из таблицы 4 также видно, что с возрастом уровни KREC и TREC будут меняться. Для этого была проведена ранговая корреляция между возрастом и уровнем KREC и TREC в группе сравнения, где были дети грудничкового периода и периода раннего детства, а также тимус у этих детей был сохранен.
Проведение ранговой корреляции по Спирмену между возрастом пациентов и кратностью TREC на 10⁵ лейкоцитарных/лимфоцитарных клеток периферической крови у детей с сохраненным тимусом выявило статистически значимую положительную ассоциацию (R_s = 0,572; p = 0,046), Эти данные указывают на потенциальный рост TREC в раннем периоде детства. Соответственно удаление тимуса в этот период является неблагополучным событием, которое может наложить отпечаток на формирование иммунной системы в этот период детства.
Проведение ранговой корреляции по Спирмену в группе детей с ВПС и сохраненным тимусом выявило статистически значимую отрицательную зависимость (R_s = -0,608; p = 0,041) количества KREC от возраста детей. Тем самым, в периоде раннего детства имеется тенденция к снижению KREC с возрастом ребенка. Полученные данные нельзя интерпретировать с популяционной позиции, так как обследовались дети с ВПС, у которых могли быть те или иные врожденные ошибки/аномалии иммунитета [7]. В то же время, анализируя возрастные зависимости TREC и KREC у детей с ВПС и сохраненным тимусом, можно говорить о прямо противоположных тенденциях (увеличение с возрастом TREC и, напротив, уменьшение KREC).
Необходимо отметить, что в представленных соотношениях «возраст-уровни KREC/TREC» были использованы данные детей грудничкового периода и младенчества с врожденными пороками сердца, в то же время при сравнении с контрольной группой было выявлено значимое уменьшение этого показателя, как для KREC, так и для TREC. Кроме того, сам по себе период новорожденности определяет различное функционирование первичных органов иммунной системы (тимуса и красного костного мозга), от депрессивного до реактивно избыточного. Тем самым, этот вопрос требует дальнейшего изучения с использованием единого методического подхода.

ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование TREC и KREC в России на мультиплексных наборах ИХБФМ СО РАН выполнялись неоднократно, в том числе на выборках условно здоровых доношенных и недоношенных новорожденных детей [7-9]. В ранее проведенных исследованиях уровни TREC и KREC определялись из сухого пятна и рассчитывались на 10⁴ лейкоцитарных клеток. Медиана TREC в цитируемом исследовании составила 641,9 копий на 10⁴ лейкоцитарных клеток, выделенных из 10 мкл периферической крови (отношение TREC(KREC) к ALB умножалось на 20000), что соответственно равно 6412 копий на 10⁵ лейкоцитов, выделенных из 100 мкл периферической крови (отношение TREC(KREC) к ALB умножалось на 200000).
В проведенном исследовании у детей с ВПС и сохраненным тимусом медиана нормированного показателя TREC была равна 3398 на 10⁵ клеток. По данным Дерябина С.С. с соавт. [7], медиана уровней TREC у новорожденных детей различных сроков гестации с пересчетом на 10⁵ лейкоцитов составляла 6419, что ниже чем в группе новорожденных детей г. Кемерово. Принимая во внимание различие в методических подходах по выделению ДНК, можно говорить лишь о тенденциях снижения уровней TREC в группах детей с ВПС и сохраненным или удаленным тимусом. Соответственно уровень TREC, и уровень наивных Т-лимфоцитов у детей с ВПС был близок к иммунодефицитному состоянию. Это вполне допустимо с учетом высокой частоты встречаемости первичных комбинированных иммунодефицитных состояний у детей с ВПС, в частности синдромом делеции 22q11.2 [10, 11]. Ранее проведенные собственные исследования клеточного состава периферической крови у детей с вынужденной тимэктомией показали развитие абсолютной или относительной нейтропении и лимфоцитопении за счет лимфоцитов различных фенотипов (CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, CD45RA+, CD31) в разных вариациях [12, 13].
В мире выполнено большое количество исследований TREC у тимусэктомированных детей. Так, Madhok A.B. [14] и Mancebo Е. et al. [15] исследовали содержание TREC у детей с врожденными пороками сердца до и после тимэктомии и обнаружили значительное снижение этой популяции у тимэктомированных детей. Снижение уровня TREC и разнообразия репертуара TCR после тимэктомии наблюдали Cavalcanti N.V. et al. [16], Gudmundsdottir J. et al. [17]. Последние, помимо этого факта, показали количественный дефект в компартменте Т-клеток, в первую очередь затрагивающий популяцию наивных Т-клеток, репликативный потенциал которых предположительно был снижен, на что указывала более короткая длина теломер Т-клеток [17]. В эту исследуемую группу включили пациентов с полной тимэктомией, прооперированных в 1993-1995 годах в возрасте не более 6 месяцев, а на момент заключительного этапа исследования возраст данных пациентов в среднем составлял 18,7 (17,2-19,9) лет [17].
По данным Донецковой А.Д. и соавт. [18, 19], полная элиминация TREC после тотальной тимэктомии у детей происходила через 3,8 года. Kimmig S. et al. [20] делают вывод, что истинное снижение TRECs является результатом снижения функции тимуса и объясняют это тем, что через 6 лет у частично тимэктомированных детей данный показатель был ниже, чем TRECs у пациентов, которые не имели тимэктомию. Кроме того, согласно современной классификации врожденных ошибок иммунитета/первичных иммунодефицитных состояний (ВОИ/ПИДС) выделяют более 400 нозологических форм, при которых нередко встречаются ВПС [21].
Исследование TREC в пяточном тесте у новорожденных детей с 2022 года вошло в обязательный неонатальный скрининг. Это позволит выделять группу новорожденных детей с фетальными аномалиями иммунитета (нулевые значения TREC и/или KREC при валидном количестве копий контрольного гена). Это особенно актуально для детей с ВПС, нуждающихся в проведении кардиохирургического лечения с вынужденным удалением тимуса. Алгоритм ведения этих детей должен включать консультацию иммунолога, проведение расширенного иммунологического и молекулярно-генетического обследования. Кардиохирургическое лечение должно проводиться с максимальным сохранением тимуса. С большой вероятностью эти дети будут направлены в федеральные центры для пересадки гемопоэтических стволовых клеток, а в периоперационном периоде они должны получать иммуноглобулин человека для внутривенного введения (ИГВВ), согласно стандартам лечения ВОИ/ПИДС по Федеральным клиническим рекомендациям по диагностике и лечению детей с тяжелой комбинированной иммунной недостаточностью (Разработан: Общественная организация Национальное общество детских гематологов, онкологов; ФГБУ «ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России. Румянцев А.Г., Масчан А.А., Щербина А.Ю. Москва, 2015. 28 с.). В других Федеральных клинических рекомендациях по диагностике и лечению синдрома делеции 22 хромосомы (Разработан: Общественная организация Национальное общество детских гематологов, онкологов; ФГБУ «ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России. Румянцев А.Г., Масчан А.А., Щербина А.Ю. Москва, 2015. 12 с.) показано, что частота таких детей в группе с ВПС равна 1 ребенок на 2000 пациентов детского возраста с ВПС. Более частой ситуацией может быть снижение ниже 1000 нормативных показателей TREC на 1000 лейкоцитов до кардиохирургического лечения. Эти дети также должны быть проконсультированы иммунологом и им должно быть проведено расширенное иммунологическое обследование, которое выделит детей для проведения молекулярно-генетического обследования. Эти дети также нуждаются в сохранении тимуса при проведении кардиохирургического лечения и, при необходимости, проведении терапии ИГВВ в периоперационном периоде.
По аналогии, сравнивая выявленные в собственном исследовании показатели KREC в периферической крови у детей с ВПС с сохраненным или удаленным тимусом, с данными новорожденных детей можно сделать вывод о их дефиците в группе детей с ВПС, как с сохраненным, так и удаленным тимусом. Это еще раз указывает на необходимость проведения исследований по единому методическому подходу, в частности выделения ДНК.
В целом, проведенное исследование указывает, что дети с ВПС являются группой, где должно проводится исключение ВОИ/ПИДС, особенно при низких TREC (нормативный показатель ниже 1000 на 10⁵ ядро-содержащих клеток периферической крови). Тот факт, что при вынужденном удалении тимуса количество TREC снижается в течение 10 дней после операции, указывает на дополнительный риск формирования иммунопатологических состояний у этих детей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, проведенное исследование показало значимое снижение нормативного показателя TREC на 10⁵ лейкоцитов периферической крови и повышение аналогичного показателя KREC у детей с ВПС и вынужденной тимэктомией по отношению к детям с ВПС и сохраненным тимусом и к новорожденным условно здоровым детям. Показана положительная корреляция между уровнем TREC и возрастом детей с ВПС и сохраненным тимусом и отрицательная корреляция с возрастом – для KREC. Мультиплексный метод исследования TREC и KREC у детей раннего возраста показал эффективность и сопоставимость результатов для различных регионов России.

Благодарности.

Институту химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН за предоставленные мультиплексные тест-системы для определения количества TREC и KREC.

Информация о финансировании и конфликте интересов

Работа выполнена при поддержке комплексной программы фундаментальных научных исследований СО РАН в рамках фундаментальной темы НИИ КПССЗ № 0419-2022-0001 «Молекулярные, клеточные и биомеханические механизмы патогенеза сердечно-сосудистых заболеваний в разработке новых методов лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы на основе персонифицированной фармакотерапии, внедрения малоинвазивных медицинских изделий, биоматериалов и тканеинженерных имплантатов».

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES:

1.      Bokeria EL, Shumakova OV, Dokshukina AA, Grebneva OS, Vasiliev GS, Grosheva EV. The structure of genetic diseases among newborns with congenital heart diseases. Children’s Heart and Vascular Diseases. 2023; 3(20): 178-190. Russian (Бокерия Е.Л., Шумакова О.В., Докшукина А.А., Гребнева О.С., Васильев Г.С., Грошева Е.В. Структура генетических заболеваний среди новорожденных с врожденными пороками сердца //Детские болезни сердца и сосудов. 2023. Т. 20, № 3. С. 178-190.) doi: 10.24022/1810-0686-2023-20-3-178-190
2.      Borisenko DV, Ivkin AA, Shukevich DL. Treatment of systemic inflammatory response syndrome following on-pump pediatric congenital heart surgery. Complex Issues of Cardiovascular Diseases. 2021; 10(2): 113-124. Russian (Борисенко Д.В., Ивкин А.А., Шукевич Д.Л. Современные методы ограничения системного воспалительного ответа при коррекции врожденных пороков сердца у детей в условиях искусственного кровообращения //Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2021. Т. 10, № 2. С. 113-124.) doi: 10.17802/2306-1278-2021-10-2-113-124
3.       Chiarini M, Zanotti C, Serana F, Sottini A, Bertoli D, Caimi L, Imberti L. T-cell receptor and K-deleting recombination excision circles in newborn screening of T- and B-cell defects: review of the literature and future challenges. J Public Health Res. 2013; 2(1): 9-16. doi: 10.4081/jphr.2013.e3
4.       Bousfiha AA, Jeddane L, Ailal F, Benhsaien I, Mahlaoui N,  Casanova J-L, Abel L. Primary immunodeficiency diseases worldwide: more common than generally thought. J Clin Immunol. 2013; 33(1): 1-7. doi: 10.1007/s10875-012-9751-7
5.      Joshi AY, Iyer VN, Hagan JB, Sauver JLS, Boyce TG. Incidence and temporal trends of primary immunodeficiency: a population-based cohort study. Mayo Clin Proc. 2009; 84(1): 16-22. doi: 10.4065/84.1.16
6.      Diller GP, Lammers AE, Fischer A, Orwat S, Nienhaus K, Schmidt R, et al. Immunodeficiency is prevalent in congenital heart disease and associated with increased risk of emergency admissions and death. Eur Heart J. 2023; 44(34): 3250-3260. doi: 10.1093/eurheartj/ehad029 ehad029
7.      Deryabina SS, Tuzankina IA, Shershnev VN. Determination of reference values for TREC and KREC in dry blood spots of newborns from different gestation ages in Sverdlovsk Region. Medical Immunology (Russia). 2018; 20(1): 85-98. Russian (Дерябина С.С., Тузанкина И.А., Шершнев В.Н. Определение нормативных значений TREC и KREC в сухих пятнах крови новорожденных разного срока гестации в Свердловской области //Медицинская иммунология. 2018. Т. 20, № 1. С. 85-98.) doi: 10.15789/1563-0625-2018-1-85-98
8.       Gordukova MA, Oskorbin IP, Mishukova OV, Zimin SB, Zinovieva NV, Davydova NV, et al. Development of real-time multiplex PCR for the quantitative determination of TREC’s and KREC’s in whole blood and in dried blood spots. Medical Immunology (Russia). 2015: 17(5): 467-478. Russian (Гордукова М.А., Оскорбин И.П., Мишукова О.В., Зимин С.Б., Зиновьева Н.В., Давыдова Н.В., и др. Разработка набора реагентов для количественного определения молекул ДНК TREC и KREC в цельной крови и сухих пятнах крови методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени //Медицинская иммунология. 2015. Т. 17, № 5. С. 467-478.) doi: 10.15789/1563-0625-2015-5-467-478
9.       Deryabina SS, Tuzankina IA, Vlasova EV, Shershnev VN. Kolichestvennaya ocenka kol`cevy`x struktur TREC i KREC u detej s narusheniyami funkcii immunnoj sistemy` na pervom godu zhizni. Medical Genetics. 2015; 2: 53-54. Russian (Дерябина С.С., Тузанкина И.А., Власова Е.В., Шершнев В.Н. Количественная оценка кольцевых структур TREC и KREC у детей с нарушениями функции иммунной системы на первом году жизни //Медицинская генетика. 2015. № 2. С. 53-54)
10.     Revyakina VA, Astafieva NG, Geppe NA, Kalyuzhin OV. Updated PRIMA consensus document to assist the practicing physician. Pediatrics. Consilium Medicum. 2021; 2: 109-112. Russian (Ревякина В.А., Астафьева Н.Г., Геппе Н.А., Калюжин О.В. Обновленный согласительный документ ПРИМА в помощь практическому врачу //Педиатрия. Consilium Medicum. 2021. № 2. С. 109-112.) doi: 10.26442/26586630.2021.2.200992
11.     Goldmuntz E. 22q11.2 deletion syndrome and congenital heart disease. Am J Med Genet C Semin Med Genet. 2020; 184(1): 64-72. doi: 10.1002/ajmg.c.31774
12.     Rovda YI, Shmulevich SA, Shabaldin AV, Shabaldina EV, Minyaylova NN, Sizova IN, Lukoyanycheva EB. Clinical and immunological characteristics of children in a catamnesis after surgery for congenital heart diseases, combined with induced thymectomy. Pediatrics. Journal named after G.N.Speransky. 2018; 97(4): 50-58. Russian (Ровда Ю.И., Шмулевич С.А., Шабалдин А.В., Шабалдина Е.В., Миняйлова Н.Н., Сизова И.Н., Лукоянычева Е.Б. Клинико-иммунологические характеристики детей в катамнезе, после операции по поводу врожденного порока сердца, сочетанной с вынужденной тимусэктомией //Педиатрия. Журнал имени Г.Н. Сперанского. 2018. Т. 97, № 4. С. 50-58.) doi: 10.24110/0031-403X-2018-97-4-50-58
13.     Rovda YI, Shmulevich SA, Shabaldin AV, Lukoyanycheva EB. (). Subpopulation profiles of T helper cells expressing CD45RA and CD31 markers in children after thymectomy performed upon surgical treatment of congenital heart disease. Medical Immunology (Russia). 2016;18(2):119-128. Russian (Ровда Ю.И., Шмулевич С.А., Шабалдин А.В., Лукоянычева Е.Б. Особенности субпопуляций Т-лимфоцитов хелперов, экспрессирующих CD45RA- и CD31-маркеры, у детей после тимэктомии, выполненной при хирургическом лечении врожденного порока сердца //Медицинская иммунология. 2016. Т. 18, № 2. С. 119-128.) doi: 10.15789/1563-0625-2016-2-119-128
14.    Madhok AB, Chandrasekran А, Parnell V, Gandhi M, Chowdhury D, Pahwa S. Levels of Recent Thymic Emigrant Cells Decrease in Children Undergoing Partial Thymectomy during Cardiac Surgery. Clin Diagn Lab Immunol. 2005; 12(5): 563-565. doi: 10.1128/CDLI.12.5.563-565.2005
15.    Mancebo E, Glemente J, Sanchez J, Ruiz-Contreras J, De Pablos P, Cortezon S, et al. Longitudinal analysis of immune function in the first 3 years of life in thymectomized neonates during cardiac surgery. Clin Exp Immunol. 2008; 154(3): 375-383. doi: 10.1111/j.1365-2249.2008.03771.x
16.    Cavalcanti NV, Palmeira P, Jatene MB, de Barros Dorna M, Carneiro-Sampaio M. Early Thymectomy Is Associated With Long-Term Impairment of the Immune System: A Systematic Review. Front Immunol. 2021; 12: 774780. doi: 10.3389/fimmu.2021.774780
17.    Gudmundsdottir J, Óskarsdóttir S, Skogberg G, Lindgren S, Lundberg V, Berglund M, et al. Early thymectomy leads to premature immunologic ageing: An 18-year follow-up. J Allergy Clin Immunol. 2016; 138(5): 1439-1443.e10. doi: 10.1016/j.jaci.2016.05.014
18.    Yarilin AA, Donetskova AD. T-cells are recent migrants from the thymus. Immunologiya. 2012; 6: 326-334. Russian (Ярилин А.А., Донецкова А.Д. Т-клетки – недавние эмигранты из тимуса //Иммунология. 2012. № 6. С. 326-334)
19.    Donetskova AD, Frolenko AL, Troshina VV, Smolyagin AI, Yarilin AA. Thymus excision rings in peripheral blood lymphocytes. Age dynamics and influence of thymectomy. Immunologiya. 2010; 6: 293-299. Russian (Донецкова А.Д., ФроленкоА.Л., Трошина В.В., Смолягин А.И., Ярилин А.А. Тимусные эксцизионные кольца в лимфоцитах периферической крови. Возрастная динамика и влияние тимэктомии //Иммунология. 2010. № 6. С. 293-299)
20.     Kimmig S, Przybylski GK, Schmidt CA, Laurisch K, Möwes B, Radbruch A, Thiel A. Two subsets of naive T helper cells with distinct T cell receptor excision circle content in human adult peripheral blood. J Exp Med. 2002; 195(6): 789-794. doi: 10.1084/jem.20011756
21.     Tangye SG, Al-Herz W, Bousfiha A, Chatila T, Cunningham-Rundles C, Etzioni A, et al. Human inborn errors of immunity: 2019 update on the classification from the international union of immunological societies expert committee. J Clin Immunol. 2020; 40(1): 24-64. doi: 10.1007/s10875-019-00737-x

Корреспонденцию адресовать:

ШАБАЛДИН Андрей Владимирович
650056, г. Кемерово, ул. Ворошилова, д. 22а,  ФГБОУ ВО КемГМУ Минздрава России
Тел: 8 (3842) 73-48-56   Е-mail: weit2007@yandex.ru

Сведения об авторах:

ШАБАЛДИН Андрей Владимирович
доктор мед. наук, профессор, профессор кафедры поликлинической педиатрии, пропедевтики детских болезней и последипломной подготовки, ФГБОУ ВО КемГМУ Минздрава России, 650056, г. Кемерово, ул. Ворошилова, д. 22а, Россия; ведущ. науч. сотрудник лаборатории пороков сердца отдела хирургии сердца и сосудов, ФГБНУ НИИ КПССЗ, 650002, г. Кемерово, бульвар акад. Барбараша, д. 6, Россия
Е-mail: weit2007@yandex.ru   ORCID 0000-0002-8785-7896

РОВДА Юрий Иванович
доктор мед. наук, профессор, профессор кафедры педиатрии и неонатологии, ФГБОУ ВО КемГМУ Минздрава России, 650056, г. Кемерово, ул. Ворошилова, д. 22а, Россия
E-mail: y.i.rovda@rambler.ru    ORCID 0000-0001-8310-5868

СИНИЦКАЯ Анна Викторовна
канд. биол. наук, науч. сотрудник лаборатории геномной медицины отдела экспериментальной медицины, ФГБНУ НИИ КПССЗ, 650002, г. Кемерово, бульвар акад. Барбараша, д. 6, Россия.
Е-mail: annacepokina@mail.ru   ORCID 0000-0002-4467-8732

ДАДОНОВА Алена Владимировна
ассистент кафедры педиатрии и неонатологии, ФГБОУ ВО КемГМУ Минздрава России, 650056, г. Кемерово, ул. Ворошилова, д. 22а, Россия
E-mail: avedernikova2015@yandex.ru    ORCID 0000-0002-9658-5220

ШМУЛЕВИЧ Светлана Александровна
канд. мед. наук, доцент кафедры поликлинической педиатрии, пропедевтики детских болезней и последипломной подготовки, ФГБОУ ВО КемГМУ Минздрава России, 650056, г. Кемерово, ул. Ворошилова, д. 22а, Россия; старший преподаватель образовательного отдела, ФГБНУ НИИ КПССЗ, 650002, г. Кемерово, бульвар акад. Барбараша, д. 6, Россия
Е-mail: shmulsa@yandex.ru    ORCID 0000-0002-9563-7471

ХАЛИВОПУЛО Иван Константинович
канд. мед. наук, зав. отделением кардиохирургии № 2, ФГБНУ НИИ КПССЗ, 650002, г. Кемерово, бульвар акад. Барбараша, д. 6, Россия
E-mail: halivopulo@mail.ru  ORCID 0000-0002-0661-4076

ЧЕРНЫХ Наталья Степановна
канд. мед. наук, доцент, доцент кафедры поликлинической педиатрии, пропедевтики детских болезней и последипломной подготовки, ФГБОУ ВО КемГМУ Минздрава России, 650056, г. Кемерово, ул. Ворошилова, д. 22а, Россия
Е-mail: nastep@mail.ru    ORCID 0000-0001-5164-7494

Information about authors:

SHABALDIN Andrey Vladimirovich
doctor of medical sciences, professor, professor of the department of outpatient pediatrics, propaedeutics of childhood diseases and postgraduate training, Kemerovo State Medical University, 650056, Kemerovo, Voroshilova St., 22a, Russia; leading researcher of the heart defects laboratory of the department of cardiovascular surgery, Scientific Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, 650002, Kemerovo, Academician Barbarasha Blvd., 6, Russia
Е-mail: weit2007@yandex.ru   ORCID 0000-0002-8785-7896

ROVDA Yuri Ivanovich
doctor of medical sciences, professor, professor of the department of pediatrics and neonatology, Kemerovo State Medical University, 650056, Kemerovo, Voroshilova St., 22a, Russia
E-mail: y.i.rovda@rambler.ru    ORCID 0000-0001-8310-5868

SINITSKAYA Anna Viktorovna
candidate of biologycal sciences, researcher of the laboratory of genomic medicine of the department of experimental medicine, Scientific Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, 650002, Kemerovo, Academician Barbarasha Blvd., 6, Russia
Е-mail: annacepokina@mail.ru   ORCID 0000-0002-4467-8732

DADONOVA Alena Vladimirovna
assistant of the department of pediatrics and neonatology, Kemerovo State Medical University, 650056, Kemerovo, Voroshilova St., 22a, Russia
E-mail: avedernikova2015@yandex.ru    ORCID 0000-0002-9658-5220

SHMULEVICH Svetlana Aleksandrovna
candidate of medical sciences, docent of the department of outpatient pediatrics, propaedeutics of childhood diseases and postgraduate training, Kemerovo State Medical University, 650056, Kemerovo, Voroshilova St., 22a, Russia; senior lecturer of the educational department, Scientific Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, 650002, Kemerovo, Academician Barbarasha Boulevard, 6, Russia
Е-mail: shmulsa@yandex.ru    ORCID 0000-0002-9563-7471

KHALIVOPULO Ivan Konstantinovich
candidate of medical sciences, head of cardiac surgery department N 2, Scientific Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, 650002, Kemerovo, Academician Barbarasha Boulevard, 6, Russia
E-mail: halivopulo@mail.ru  ORCID 0000-0002-0661-4076

CHERNYKH Natalya Stepanovna
candidate of medical sciences, docent, docent of the department of outpatient pediatrics, propaedeutics of childhood diseases and postgraduate training, Kemerovo State Medical University, 650056, Kemerovo, Voroshilova St., 22a, Russia
Е-mail: nastep@mail.ru    ORCID 0000-0001-5164-7494